案例二：长牡蛎左右外套膜功能差异研究
研究背景
生物体的不对称发育一直是学界研究的焦点问题，TGF-β 通路的 Pitx2 基因在脊椎动物不对称器官的形成过程中发挥重要作用。但是，Pitx 基因在无脊椎动物的调控机制知之甚少。牡蛎的壳是由外套膜生物矿化形成的，左外套膜形成左壳，右外套膜形成右壳。长牡蛎的左壳通常比右壳大，左壳可以很牢固的附着到其它物体表面，而右壳却不能。左右壳功能的不同也就意味着左右外套膜分子的差异。本研究首次在双壳贝类中开展了左右不对性的分析，创新性的对贝类对称器官的功能差异开展分析。
研究内容
欧易生物携手鲁东大学，对长牡蛎左、右外套膜分别进行了转录组测序、MethylRAD 全基因组甲基化检测、small RNA 测序（1 个左外套膜 vs 1 个右外套膜），结果发现 cgPitx 基因在右外套膜高表达，并且该基因启动子区的甲基化水平在左、右外套膜差异显著。small RNA 测序和 TGF−β 受体抑制剂实验，进一步证明 TGF−β 信号通路与牡蛎外套膜左、右不对称相关。
研究结果
1. 左外套膜和右外套膜的差异表达基因共 176 个，GO 和 KEGG 富集分析表明这些差异基因多集中在应激反应、代谢过程等生物学过程。同时，胞外区域等相关差异基因占比很大，表明左、右外套膜的胞外蛋白是不同的。6 个基因（包括 Pitx 基因）的定量 PCR 结果与转录组结果一致。
2. 发现与壳形成相关的基因（如 Perlucin、Nacrein1）在左、右外套膜上的表达量不同，表明牡蛎左壳和右壳的生物矿化机制不同；一些与信号转导或神经活动有关的基因（如 KCP、Temptin、cgPitx、Plasminogen）在右外套膜高表达，表明右外套膜对信号转导或神经活动更敏感；6 个过氧化物酶基因在右外套膜高表达，表明右壳在非特异性免疫防御的氧化应激方面可能起到更大的作用。另外，决定左右不对称的关键基因 cgPitx 在右外套膜高表达，且在桑椹胚、囊胚就表达，说明牡蛎的左右不对称在早期就已确定。
3. 采用 MethylRAD 技术分析牡蛎左、右外套膜的甲基化变化，491个 CCGG 位点甲基化水平存在差异，828 个 CCWGG位点甲基化水平存在差异。GO、KEGG 富集分析表明差异甲基化基因可能调控长牡蛎的能量代谢和信号转导。
4. 与右外套膜相比，cgPitx 基因启动子区的一个 CCGG 位点的甲基化水平显著高于左外套膜，该位点的焦磷酸测序结果与MethylRAD 结果相吻合。甲基化与转录组的联合分析发现，该位点的甲基化水平与基因表达呈正相关，这是在螺旋动物中的首次发现。
5. 本研究发现左、右外套膜 29 个差异表达的 miRNA，4 个靶基因 (TGFBR1, ACVR2B, SMAD2/3, SARA) 与 TGF−β 信号通路相关，且位于 Pitx 基因的上游，可能会影响 Pitx 基因的表达。表明 miRNA 也参与左、右外套膜的分化。
6. TGF−β 信号通路的抑制剂加入到牡蛎的不同阶段，长牡蛎由左、右不对称变为左、右对称，说明 TGF−β 信号通路对长牡蛎左、右外套膜的不对称具有重要作用。
参考文献：
Wei L, Xu F, Wang Y, et al. The Molecular Differentiation of Anatomically Paired Left and Right Mantles of the Pacific Oyster Crassostrea gigas. Mar Biotechnol 2018; 20(4): 425-435. (IF: 2.748)
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